本发明提供了一种蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测方法，其是针对蜡蚧轮枝菌的ITS片段中的种特异序列，设计出特异性引物和Taqman-TAMRA探针，建立了快速检测蜡蚧轮枝菌的Real-time PCR检测方法。该方法具有较高的灵敏性和良好的特异性，所检测的含有蜡蚧轮枝菌的样品均显示为阳性结果，所检测的近缘种及常见环境杂菌均为阴性结果。本方法可以检测到100个拷贝/反应体系的目的片段。同时进行了昆虫宿主或土壤模拟标本的检测，单头蚜虫接种培养3d时虫体内含有的蜡蚧轮枝菌的菌量即可被检出，土壤模拟标本中1.0×10
1.蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针，其特征在于，所述引物对包括：正向引物LecF27：5’-CTCCCAAACCCTTATGTGAACATAC-3’反向引物LecR149：5’-GCGGATTCAGAAAATGCTGATAA-3’，所述探针为LecP28：5’-FAM-TACTGTTGCTTCGGCGGACTCGCC-TAMRA-3’。
2.含有权利要求1所述的引物对和探针用于种水平检测蜡蚧轮枝菌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTPs、Taqxa0DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括标准阳性模板。技术领域
本发明涉及蜡蚧菌轮枝菌的分子生物学检测，具体地说，涉及一种蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测方法。
背景技术
蜡蚧轮枝菌(Lecanicilliumxa0Lecanii)是重要的虫生真菌，对刺吸式害虫具有很好的防治效果，在西欧、苏、美、中等许多国家和地区已有广泛的应用。蜡蚧轮枝菌对作物害虫的防治效果是由其对害虫的毒力(内在因素)和环境因子的影响(外在因素)综合决定的。在评价蜡蚧轮枝菌对害虫的毒力中，传统的生物测定方法仅可统计染病且死亡的害虫，而对染病但未死亡的害虫无能为力；在研究蜡蚧轮枝菌生态适应能力中，目前尚未发展出有效定量检测该菌的方法。实时荧光定量PCR依赖与特异性引物和探针，特异地检测靶标菌的特定核酸序列，通过核酸数量来放映靶标菌的数量，是当前真菌定量检测的最有效技术手段，在白僵菌或绿僵菌的某些特定菌株的定量检测应用中已取得成功。蜡蚧轮枝菌的定量检测技术缺乏，制约了该菌众多关键基础研究的深入，严重限制了蜡蚧轮枝菌应用研究的进一步发展。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测方法。为了实现以上目的，本发明提供蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针。所述引物对包括：正向引物LecF27：5’-CTCCCAAACCCTTATGTGAACATAC-3’、反向引物LecR149：5’-GCGGATTCAGAAAATGCTGATAA-3’。所述探针为LecP28：5’-FAM-TACTGTTGCTTCGGCGGACTCGCC-TAMRA-3’本发明还提供含有上述引物对和探针的用于种水平检测蜡蚧轮枝菌的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taqxa0DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供一种蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：1)提取样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述引物LecF27和LecR149及探针LecP28进行荧光定量PCR扩增反应；3)分析PCR产物。所述PCR反应体系以20μl计为：1μLDNA模板(约10ng)、10μlxa0Perfectstartxa0Taqmanxa0qPCRxa0masterxa0mix(Omega公司)、0.4μl正向引物LecF27(10μM)、0.4LecR149μl反向引物(10μM)、0.2μl荧光探针LecP28(10pM)、灭菌双蒸水8μL。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；在每个循环72℃延伸时读取反应荧光值。真菌核糖体rDNA的序列碱基存在高度保守但又不乏变异的特点，其中转录间隔序列(ITS)已经公认为是真菌种类鉴定的最重要区域。本发明针对ITS片段设计了荧光定量PCR检测引物对和探针，并基于Taqman-TAMRA探针Real-timexa0PCR技术，建立针对蜡蚧轮枝菌种水平的快速检测方法。具体地，针对蜡蚧轮枝菌的ITS片段中的种特异序列，应用ABIxa0Primerxa0Expressxa03.0软件，设计出引物和Taqman-TAMRA探针，建立Real-timexa0PCR检测方法：把目的片段克隆到pEasy载体上，绘制标准曲线；以蜡蚧轮枝菌DNA梯度稀释样品检测引物探针的灵敏性，以近缘种及常见环境杂菌验证引物探针的特异性；制备昆虫宿主或土壤模拟标本评价本方法在实际样品检测中的应用。结果表明，从标准曲线可以看出，该方法可以检测到100个拷贝/反应体系的目的片段，特异性检测显示仅含有蜡蚧轮枝菌DNA的样品有荧光信号，其他近缘种及常见环境杂菌均无荧光信号，单头昆虫宿主模拟标本中的蜡蚧轮枝菌可以被检出，土壤模拟标本中1.0×10²个孢子/克土的蜡蚧轮枝菌可以被检出。因此，本发明以ITS片段为靶基因建立的Real-timexa0PCR检测方法对蜡蚧轮枝菌种水平的检测特异性好、灵敏度高，可快速、准确地用于样品的定量检测。
附图说明
图1为本发明实施例2中靶标菌和干扰菌的Real-timexa0PCR检测荧光信号图。图2为本发明实施例2中质粒标准品的Real-timexa0PCR检测荧光信号图。图3为本发明实施例2中根据质粒标准品绘制的Real-timexa0PCR标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1：用于蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针的合成针对蜡蚧轮枝菌的ITS片段中的种特异序列，应用ABIxa0Primerxa0Expressxa03.0软件，设计出如表1所示的引物和Taqman-TAMRA探针，由上海生工生物公司合成。表1xa0蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例2：蜡蚧轮枝菌种水平荧光定量PCR检测方法1材料与方法1.1菌株本实验中用到的真菌菌株均为单孢菌株，其中菌株FZ9906为典型的蜡蚧轮枝菌(L.lecanii)菌株，经过形态和分子分类学鉴定。用于特异性检测的真菌包括大丽轮枝菌(Verticilliumxa0dahliae)、球孢白僵菌(Beauveriaxa0bassiana)、金龟子绿僵菌(metarhiziumxa0anisopliae)、玫烟拟青霉(Paecilomycesxa0fumosoroseus)、尖镰孢菌(Fusariumxa0oxysporum)和链格孢菌(Alternariaxa0alternata)。真菌菌株采用PDA平板培养，黑暗条件25℃培养7天后收集菌丝用于提取总DNA。1.2xa0DNA提取总DNA提取采用CTAB法，取适量菌丝、昆虫样品或土壤样品，加入适量灭菌石英砂，液氮条件下研磨精细。将样品粉末加入2mlxa0Eppendorf离心管中，加入1mlxa02％CTAB抽提缓冲液和0.1ml10％SDS溶液，充分混匀，65℃孵化3h后，10000rpm离心10min，取上清800μl加入新的Eppendorf离心管中，然后加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，涡旋机混匀，12000rpm离心5min，取上清650μl加入新的Eppendorf离心管中，二次加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，涡旋机混匀，12000rpm离心5min，取上清400μl加入等体积冷的异戊醇，-20℃沉淀30min以上，12000rpm离心2min，弃上清，700μl70％乙醇洗脱2次，自然晾干，加20μlxa0TE溶液溶解，-20℃保存备用。1.3试剂和仪器设备Perfectstartxa0Taqmanxa0qPCRxa0masterxa0mix荧光定量PCR试剂盒、小量质粒提取试剂盒、核酸纯化试剂盒均购自美国Omega生物技术有限公司，Top10大肠杆菌感受态细胞和pEasy载体购自北京全式金生物技术有限公司。荧光定量PCR仪为ABIxa07500xa0Real-timexa0PCRxa0System。1.4反应体系与条件PCR反应体系以20μl计为：1μlxa0DNA模板(约10ng)、10μlxa0Perfectstartxa0Taqmanxa0qPCRxa0masterxa0mix(Omega公司)、0.4μl正向引物LecF27(10μM)、0.4LecR149μl反向引物(10μM)、0.2μl荧光探针LecP28(10pM)、灭菌双蒸水8μl。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；在每个循环72℃延伸时读取反应荧光值。1.5灵敏度检测以蜡蚧轮枝菌DNA梯度稀释样品(10⁴拷贝/μl～10⁰拷贝/μl)为模板进行Real-timexa0PCR，检测引物及探针的灵敏性。1.6特异性检测以典型的蜡蚧轮枝菌(L.lecanii)菌株，近缘种大丽轮枝菌(V.dahliae)、球孢白僵菌(B.bassiana)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)、玫烟拟青霉(P.fumosoroseus)，以及常见环境杂菌尖镰孢菌(F.oxysporum)和链格孢菌(A.alternata)为模板进行Real-timexa0PCR，检测引物及探针的特异性。1.7标准曲线检测1.7.1质粒标准品以LecF27和LecR149为引物，扩增目的片段144bp；切胶回收，纯化PCR产物；连接到pEasy载体；导入Top10大肠杆菌感受态细胞；筛选阳性克隆子，通过PCR进行验证，最终测序进一步确认；提取质粒。1.7.2质粒拷贝数换算测定质粒DNA的浓度为358.33ng/μl，根据质粒的分子量(3015bp)将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度；每μl样品中检测基因的拷贝数＝浓度(ng/μl)×阿伏伽德罗常数×10^-9/(660×重组质粒碱基数。由此得到的蜡蚧轮枝菌质粒拷贝数为1.035×10¹¹拷贝/μl。1.7.3标准曲线用无菌蒸馏水将上述质粒梯度稀释成1.0×10⁷拷贝/μl～1.0×10⁰拷贝/μl，共8个浓度梯度，每个浓度梯度作3个平行样本进行Real-timexa0PCR反应。1.8昆虫宿主模拟标本检测1.8.1蜡蚧轮枝菌孢子悬浮液制备蜡蚧轮枝菌菌株接种于PDA培养基上，25℃培养7d。刮取新鲜的生长一致的孢子，以0.05％的无菌吐温80稀释，用孢子分散器分散均匀，在显微镜下用血球计数板分别将浓度调至10⁶个孢子/ml。1.8.2蚜虫接种与取样选取虫龄一致的蚜虫成虫，放到7.5cm直径布氏漏斗中的滤纸上，将30ml的孢子悬液缓缓倒入漏斗以浸没蚜虫，二秒钟后迅速抽干，用细毛笔将其接在铺于水琼脂上的甘蓝叶片上，每片叶接入30头蚜虫，对照组为0.1％的吐温80无菌水。每个处理重复三次，分别于接种后1d、2d、3d、4d、5d、6d取样。蚜虫虫体用0.5％双氧水表面消毒5min，挑出用无菌蒸馏水洗涤3次，晾干后用于DNA提取。1.8.3蚜虫样品DNA提取与检测蚜虫样品DNA提取方法如上述，以所得DNA为模板分别进行Real-timexa0PCR反应，每个样品重复3次。1.9土壤模拟标本检测1.9.1蜡蚧轮枝菌孢子悬浮液制备蜡蚧轮枝菌菌株接种于PDA培养基上，25℃培养7d。刮取新鲜的生长一致的孢子，以0.05％的无菌吐温80稀释，用孢子分散器分散均匀，在显微镜下用血球计数板分别将浓度调至1.0×10⁶拷贝/μl、1.0×10⁴拷贝/μl、1.0×10²拷贝/μl和1.0×10¹拷贝/μl。1.9.2土壤处理与接种将田间采回的一部分土壤置于200℃烘箱内干热灭菌8h，作为接种土壤备用。分别各取1ml新鲜配制的不同浓度的孢子悬浮液，接入盛有1g灭菌土的15ml离心管内，置于涡旋仪上以最大速度振荡5min，充分混匀，以接无菌水的灭菌土为对照。每个处理重复三次，晾干后用于DNA提取。1.9.3土壤样品DNA提取与检测土壤样品DNA提取方法如上述，以所得DNA为模板分别进行Real-timexa0PCR反应，每个样品重复3次。2结果2.1灵敏度检测用针对蜡蚧轮枝菌ITS片段的Real-timexa0PCR方法检测蜡蚧轮枝菌DNA梯度稀释样品(10⁴拷贝/μl～10⁰拷贝/μl)，其中10⁴拷贝/μl、10³拷贝/μl、10²拷贝/μl的结果均为阳性，10¹拷贝/μl、10⁰拷贝/μl和无菌水对照的结果为阴性。2.2特异性检测用针对蜡蚧轮枝菌ITS片段的Real-timexa0PCR方法检测典型的蜡蚧轮枝菌(L.lecanii)菌株，近缘种大丽轮枝菌(V.dahliae)、球孢白僵菌(B.bassiana)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)、玫烟拟青霉(P.fumosoroseus)，以及常见环境杂菌尖镰孢菌(F.oxysporum)和链格孢菌(A.alternata)，结果除蜡蚧轮枝菌为阳性外，其他真菌均为阴性(图1)。2.3标准曲线检测当质粒浓度为1.0×10⁷拷贝/μl～1.0×10²拷贝/μl时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增为阳性，而质粒浓度为1.0×10¹拷贝/μl和1.0×10⁰拷贝/μl时，每个浓度的3个平行样均未出现扩增。依据每个反应体系加1μl计算可知，本Real-timexa0PCR方法的检测下限为100拷贝/反应体系(图2)。以质粒拷贝数的对数为横坐标，以相应的循环C_T值为纵坐标，绘制标准曲线Y＝-3.1423X+43.684(R²＝0.9932)(图3)，由此可知，当质粒浓度在1.0×10⁷拷贝/μl～1.0×10²拷贝/μl范围内时，质粒拷贝数的对数值与CT值具有非常好的线性相关性。2.4昆虫宿主模拟标本检测从表2可以看出，蚜虫接种蜡蚧轮枝菌后培养1d、2d、3d、4d时仍为活虫，培养5d时死亡且体表开始长出菌丝，培养6d时菌丝完全覆盖虫体；Real-timexa0PCR结果显示，接种蜡蚧轮枝菌培养1d和2d时的蚜虫的所有平行样的扩增结果均为阴性，培养3d时扩增结果变为阳性。由此可知，本Real-timexa0PCR体系用于昆虫宿主模拟样本时，单头蚜虫接种蜡蚧轮枝菌后培养3d时即可被检出，此时蚜虫仍处于被真菌侵染的早期。表2xa0昆虫宿主模拟样本的Real-timexa0PCRntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>2.5土壤模拟标本检测从表3可以看出，当土壤加入的菌量为1.0×10⁶个孢子/克土、1.0×10⁴个孢子/克土、1.0×10²个孢子/克土时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性；加入菌量为1.0×10¹个孢子/克土时，3个平行样均扩增阴性；对照样品的扩增阴性。由此可知，本Real-timexa0PCR体系用于土壤模拟样本时，1.0×10²个孢子/克土的含菌量可被检出。表3xa0土壤模拟样本的Real-timexa0PCRntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>